Estudio en la Universidad de Salamanca donde consiguió brillantemente el titulo de licenciado en Derecho civil y canónico. Más tarde obtuvo el cargo de Juez de apelación en la curia arzobispal de Zaragoza.y después D. Fernando Niño de Guevara, Patriarca de las Indias y obispo de Sigüenza, le nombro provisor de su Diócesis.

Influido por este Patriarca, Felipe II le concedió el cargo de Oidor en la Chancillería de Valladolid y mas tarde en la Casa de Contratación de Sevilla. Contaría el Licenciado por entonces con cuarenta años. Desde aquí Felipe II le nombra regente en el Consejo Real de Navarra.

Debió ejercer su cometido satisfactoriamente, pues antes de cumplir cuarenta y nueve años de edad, el día tres de Mayo de 1562, el Rey le concedió la placa de Consejero en el Consejo Supremo y Real de Castilla. A los dos años, en 1964, recibió ordenes sacerdotales.

El día 10 de Agosto de 1565, debido a la muerte del Presidente del Consejo Supremo y Real de Castilla y por deseo de este, Felipe II nombra a D. Diego para ocupar la presidencia. Este cargo gozaba de la mayor confianza del soberano.

El día 9 de Septiembre de 1565 y a petición del rey, el pontífice Pío V, por Bula expedida en Roma, designa a D. Diego Espinosa para sustituir al Inquisidor General D. Fernando Valdés. El 4 de Diciembre toma posesión del cargo. En esta época comienza su agitadisima vida política compuesta por sus obligaciones en los tres campos, el Consejo Supremo, el Tribunal de la Inquisición y al servicio del Rey.

En 1567 los problemas del Imperio español se agudizan, en especial los ocasionados por los rebeldes en Flandes. Felipe II decide acudir allí personalmente y dejar como regente del reino al Licenciado Espinosa. Para proporcionarle mayor dignidad, el Rey solicita al Papa el capelo cardenalicio. Pío V se lo concede el 24 de Marzo de 1568.
Un año después es nombrado Obispo de Sigüenza, una de las sedes más ricas de España, una vez mas propuesto por el Soberano. Es incluido en la junta formada "para causar proceso justificando la prisión y causa" del príncipe Carlos y hasta finales de Marzo de 1569 no visita la Diócesis.

En 1569, el Rey le mandó "comprar algún lugar, y que honraría su casa con titulo de Marques", pero el cardenal no aceptó y le pidió a cambio que concediera una feria franca a la Villa de Martín Muñoz de las Posadas. Así concedió el 7 de Agosto un día a la semana de mercado, los lunes, y una semana al año de feria, el 21 de Septiembre. También le mando Felipe II que construyera una casa en honor de los suyos, pero el cardenal no accedió alegando que "le parecía muy mal, que ministros ejemplares edificasen palacios, que ponían en escrúpulo a todos los que pasaban y se daba lugar a los discursos libres de la corte". El rey insistió y él impuso la condición de poner el escudo real para significar que había sido un mandato de Felipe II. Así se construyó el Palacio que lleva su nombre cerca de la Plaza Mayor de la Villa.

Con cincuenta y nueve años contrae un rápida enfermedad que le lleva a la muerte el 5 de Septiembre, cerca de las diez de la mañana. Fue tan repentina que el ultimo documento de la inquisición que firmo data del 28 de Agosto. Sobre la causa, no la enfermedad, real de la muerte circulan varias versiones, se cree que causado por la decisión del rey de sustituirle en la presidencia de un consejo sufrió un accidente, y creyéndole muerto le realizaron la autopsia sin estarlo. Fue enterrado en la Villa de Martín Muñoz de las Posadas, en la capilla que él mismo había fundado, con el siguiente epitafio:

DON DIEGO DE ESPINOSA, OBISPO DE SIGVENZA, CARDENAL DE SAN ESTEVAN, PRESIDENTE DE LOS CONSEJOS REAL Y DE LA INQVISICION, DOTO ESTA CAPILLA CON NVEVE CAPELLANES PERPETVOS. DON DIEGO DE ESPINOSA, SV SOBRINO, APOSENTADO MAYOR DEL REY FELIPE SEGVNDO, PRIMER PATRON, LO MANDO PONER AÑO M.D. LXII

A lo largo de su vida se creo numerosos enemigos políticos pero el Rey dijo de él: "Tengo un Ministro cortado a la medida de mi deseo y provecho universal de mis súbditos..." y cuando murió dijo a sus hijos "Aquí está enterrado el mejor de mis Ministros..."